开心飞鹰歡迎您的到來!

産品列表PRODUCTS LIST

首頁 > 技術與支持 > 細胞周期的四種檢測方法詳解
細胞周期的四種檢測方法詳解
點擊次數:6450 發布時間:2018-07-14

細胞周期指細胞一個世代所經曆的時間。從一次細胞分裂結束到下一次分裂結束為一個周期。細胞周期反應了細胞增殖速度。細胞周期是一個重要的檢測參數,研究細胞周期變化的影響對于腫瘤的發展及藥物研發有着重要的作用。例如,已知抑制有絲分裂的化合物大都用來減緩腫瘤細胞的生長。

細胞周期内有兩個階段為重要:G1 到 S 和 G2 到 M;這兩個階段正處在複雜活躍的分子水平變化的時期,容易受環境條件的影響,如果能夠人為地進行調控,将對深入了解生物的生長發育和控制腫瘤生長等有重要意義。能夠方便有效地檢測細胞周期的變化,對于藥物研發和疾病研究等都具有重要的意義。

單個細胞的周期測定可采用縮時攝影的方法,但它不能代表細胞群體的周期,故現多采用其他方法測群體周期。

那麼,細胞周期的測定如何進行的呢?測定細胞周期的方法很多,有同位素标記法、流式細胞儀法、基于細胞成像的熒光檢測法等。

一、同位素标記法測定細胞周期

标記有絲分裂百分率法 (PLM) 是一種常用的測定細胞周期時間的方法。其原理是對測定細胞進行脈沖标記、定時取材、利用放射自顯影技術顯示标記細胞,通過統計标記有絲分裂細胞百分數的辦法來測定細胞周期。

測定原理:

① 待測細胞經 3H- 胸腺嘧啶核苷标記後,所有 S 期細胞均被标記。
② S 期細胞經 G2 期才進入 M 期,所以一段時間内 PLM = 0。
③ 開始出現标記 M 期細胞時,表示處于 S 期後階段的細胞,已渡過 G2 期,所以從 PLM = 0 到出現 PLM 的時間間隔為 G2期的持續時間。
④ S 期細胞逐漸進入 M 期,PLM 上升,到達到點的時候說明來自處于 S 後階段的細胞,已完成 M,進入 G1 期。所以從開始出現 M 到 PLM 達到點 (≈ 100%) 的時間間隔就是 M 期的持續時間。
⑤ 當 PLM 開始下降時,表明處于 S 期初階段的細胞也已進入 M 期,所以出現 LM 到 PLM 又開始下降的一段時間等于 S 期的持續時間。

二、流式細胞儀 PI 染色法

細胞周期分為間期與分裂期兩個階段。間期又分為三期:即 DNA 合成前期 ( G1 期 )、DNA 合成期 ( S 期 ) 與 DNA 合成後期 ( G2 期 )。某些細胞在分裂結束後暫時離開細胞周期,停止細胞分裂,執行一定生物學功能 ( G0 期 )。

檢測細胞周期的原理:

由于細胞周期各時相的 DNA 含量不同,通常正常細胞的 G1 / G0 期具有二倍體細胞的 DNA 含量 ( 2N ),而 G2 / M 期具有四倍體細胞的 DNA 含量 (4N),而 S 期的 DNA 含量介于二倍體和四倍體之間。PI可以與 DNA 結合,其熒光強度直接反映了細胞内 DNA含量。因此,通過流式細胞儀 PI 染色法對細胞内 DNA 含量進行檢測時,可以将細胞周期各時相區分為 G1 / G0 期,S 期和 G2 / M期,獲得的流式直方圖對應的各細胞周期可通過特殊軟件計算各時相的細胞百分率。

三、基于成像的熒光檢測法

FUCCI (fluorescent ubiquitination-based cell-cycle indicator) 小球能鑒别細胞處在細胞周期的哪一時期,因此可以用來研究癌症細胞周期的進程。FUCCI 技術建立在鑒定過表達的兩種調節細胞周期的蛋白 geminin 和 Cdt1 水平上,其中 geminin 融合的是綠色熒光基團 AmCyan,而 Cdt1 融合的是紅色熒光基團 mCherry。Cdt1 和 geminin 的水平随着細胞周期的變化而不斷波動:Cdt1 蛋白水平在 G1 階段達到峰值,而 geminin 蛋白水平在 S,G2 和 M 期不斷升高。這一結果體現為表達 FUCCI 細胞核在G1 期為紅色而在 S,G2 和 M 期則呈現綠色 ( 圖 2 )。

1 檢測方法

A375S FUCCI 球體準備的方法如下:Corning 公司 96 孔 U 型底低吸附細胞培養闆中加入含有 EGF (20 ng / mL) 和 B27 (1×)的 DMEM / F 12 培養基,按每孔 1,000 細胞進行種闆。細胞闆離心 (800 g,6 min) 後在 37 ℃,5% CO2條件下進行孵育。後,用含 10% FCS 的培養基清洗球體 3 次以移除 EGF 和 B27,繼續培養 1 至 6 天。

2 數據分析

MiniMax 細胞計數儀的透射光模塊可以從自動聚焦得到更好的圖像效果。SoftMax Pro 軟件中的“Field Analysis”能進行自定義分析從而鑒别細胞重疊的部分。我們應用一種特殊的鑒别方法來區分目标球體和其餘物體,如殘渣和個體細胞,從而在後續的分析中予以去除 (Figure 2, A and E)。後,我們選擇感興趣的區域并從圖像中去除不想要的物體。在綠色和紅色熒光通道中,球體可以通過“Object Count”模式中大小和與背景相對熒光強度的區别被輕易的篩選出來 (Figure 2, B-D, F-G)。然後運用SoftMax Pro 軟件計算圖像的“% Area coverage”和球體的“Object Area” (μm2)。圖像的獲取和分析的設置方法見表 1。

3 結果

SoftMax Pro 軟件中獲取及分析的設置可以在綠色和紅色熒光通道的透射光下簡便快速地分辨每個孔中的單球體。SoftMax Pro軟件還可計算所有通道包含的面積占比和物體面積 (μm2) (圖 3,表 2)。在綠色和紅色熒光通道下可以獲得的結果。對于 FUCCI 球體來說,圖 3 中紅色部分展示的是光滑圓潤的球體而綠色部分則在細胞表面,說明球體内部的細胞處在 G1 期而表面細胞即将進入 M 期。對應軟件可以分辨球體大小和形狀 ( 球形參數 ) 的各種變化,因此常用來研究多種處理,如抗癌藥物,對細胞增殖的影響 ( 圖4 )。MiniMax 中綠色和紅色熒光的光學成形功能可以将 3D 圖像轉換為 2D 投射球體圖。

四、高内涵檢測法

方法

1. 準備細胞懸液,40,000 細胞 / mL 的 Hela 細胞懸液與 30 顆粒 / 細胞濃度的 FUCCI 試劑混合,以 4,000 細胞 / 孔的濃度種在 96 孔闆中,孔闆置于 37 °C,5% CO2 的環境下貼壁 8 小時。
2. 不同濃度的有絲分裂抑制劑處理細胞,然後孔闆放入 ImageXpress Micro 系統。
3. 每隔 2-3 小時系統自動拍攝一次圖片,使用 20 倍 Plan Apo 物鏡,同時獲取明場及兩個熒光通道 FITC 和 TRITC 的圖像。實驗持續 48 - 72 小時,細胞可完成 1 - 2 次分裂。
4. 分析延遲實驗圖像使用 MetaXpress® 高内涵成像與分析軟件的用戶自定義模塊。

Premo® FUCCI 細胞周期指示劑結合配置環境控制的 ImageXpress Micro 高内涵成像系統和 MetaXpress 高内涵分析軟件,可實現的活細胞周期測量。高通量篩選技術可為科學家提供一個快速、自動的基于圖像定量分析細胞周期的方法,并能夠完整地記錄長時間内的細胞周期變化。另外,MetaXpress 軟件能夠在明場圖像識别細胞,避免了染料對活細胞的毒性。同一标準具有統計學意義的定量分析方法可評價多化合物在不同濃度對細胞周期影響的相關參數。

在線客服